現(xiàn)如今越來越多消費者追求營養(yǎng)的多樣性、易于吸收性和平衡性，酵素發(fā)酵飲料作為新型功能性食品逐漸被大眾喜愛。食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、豆谷類、藥食兩用食材等為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵制得的富含有機酸、益生菌、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，具有解酒護肝、美白抗氧化、降糖降脂等功效。

蕓豆（Phaseolus vulgaris Linn）學名菜豆，屬蝶形花科的小宗雜糧作物，是栽培面積僅次于黃豆的豆類農(nóng)作物。蕓豆富含蛋白質(zhì)、維生素、皂苷等營養(yǎng)成分，蕓豆膳食纖維、山奈酚、槲皮素可持續(xù)性調(diào)控機體糖代謝紊亂，改善胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能，維持血糖水平穩(wěn)態(tài)。蕓豆抗性淀粉、α-淀粉酶抑制劑可以降低高脂血癥大鼠血脂代謝水平，改善氧化應(yīng)激并調(diào)控腸道微生物平衡。黃酮類化合物對心血管疾病、癌癥等老年疾病有積極的預(yù)防、緩解和治療作用。蕓豆提取物還具有補腎利氣、抗炎抑菌、利水消腫等多種功效，是開發(fā)功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料。

基于蕓豆主要以鮮食為主，存在加工形式及企業(yè)較少、綜合利用程度差等問題，同時目前鮮見復合益生菌發(fā)酵蕓豆酵素的研究，其代謝產(chǎn)物及抗氧化能力亦沒有報道。監(jiān)測發(fā)酵體系代謝產(chǎn)物及抗氧化活性，是反映蕓豆酵素發(fā)酵進程、產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)價值的重要依據(jù)。因此，本文以蕓豆酵素為研究對象，研究不同發(fā)酵時間代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，分析其抗氧化能力，為蕓豆高值利用及精深加工產(chǎn)業(yè)鏈提供新思路，同時為綜合開發(fā)兼具蕓豆和益生菌營養(yǎng)保健價值的蕓豆酵素產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1、pH和總酸含量的變化

pH是衡量發(fā)酵過程是否正常的重要條件，酸度是衡量酵素成熟度及發(fā)酵液品質(zhì)的主要指標之一。由圖1可知，發(fā)酵液pH隨著發(fā)酵時間的延長而不斷降低，總酸含量則逐漸升高。經(jīng)48h發(fā)酵，蕓豆酵素pH由4.01降低至3.44，總酸含量從發(fā)酵初期0.03g/100mL至后期增漲至0.57g/100mL。發(fā)酵前期總酸含量增幅明顯，分析原因該階段酵母菌大量增殖，在厭氧條件下利用發(fā)酵液中的糖原產(chǎn)生CO₂及乙醇，部分CO₂溶于發(fā)酵液，同乳酸作用，降低發(fā)酵液pH的同時增加總酸含量。接種乳酸菌后其分泌酶水解發(fā)酵液中碳源為單糖后進一步利用產(chǎn)生大量乳酸、蘋果酸等有機酸，導致發(fā)酵液pH持續(xù)降低，總酸含量穩(wěn)定增長。蕓豆酵素發(fā)酵56h時，發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)基本被完全消耗，乳酸菌利用有機酸作為代替碳源來維持自身增殖代謝等生物過程，使得總酸含量小幅度升高。發(fā)酵體系含多種有機酸，可抑制部分有害菌的生長，同時形成了蕓豆酵素的獨特風味。

2 、還原糖含量與可溶性固形物含量的變化

糖作為碳源是微生物發(fā)酵的重要營養(yǎng)物質(zhì)，其含量的變化是反應(yīng)酵素液中微生物活動情況的指標之一。由圖2所示，還原糖含量僅在前8h呈現(xiàn)上升趨勢，而后隨著發(fā)酵時間的延長而不斷降低。這可能是由于發(fā)酵初期優(yōu)勢菌種酵母菌在蔗糖酶的作用下將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖，使發(fā)酵液中還原糖含量增加。發(fā)酵8~24h時，還原糖含量下降較快，該階段酵母菌已適應(yīng)此時發(fā)酵環(huán)境，大量的葡萄糖和果糖被利用生成乙醇用于代謝生長。發(fā)酵液中果糖等游離糖利于乳酸菌等厭氧微生物增殖生長，接種乳酸菌其自身分泌β–半乳糖苷酶等水解酶分解乳糖成葡萄糖和半乳糖，并通過糖酵解等代謝途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸，還原糖逐漸減少。發(fā)酵48h時，還原糖含量為3.55mg/mL并趨于平緩，證明發(fā)酵已基本結(jié)束。

可溶性固形物含量可較為直觀反映發(fā)酵液品質(zhì)，若含量過高，發(fā)酵體系滲透壓升高易破壞發(fā)酵菌種細胞壁及細胞膜特性，導致生長周期停滯或凋亡；含量過低，發(fā)酵液口感酸，影響產(chǎn)品風味。由圖2可知，蕓豆酵素可溶性固形物含量隨發(fā)酵時間的延長持續(xù)下降并趨于穩(wěn)定，經(jīng)48h的發(fā)酵，發(fā)酵液中可溶性固形物含量由17.07%降低至6.13%，發(fā)酵體系環(huán)境適宜，營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物在該階段迅速繁殖，大量且持續(xù)利用碳水化合物，使得蕓豆酵素可溶性固形物含量逐漸降低。

3、總酚與黃酮含量的變化

蕓豆酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化見圖3?？偡雍吭诎l(fā)酵階段呈先迅速上升后小幅度下降而后繼續(xù)增長的趨勢。楊小幸等研究表明發(fā)酵體系中酚類物質(zhì)含量的變化與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝條件及微生物種類密切相關(guān)。與未發(fā)酵清汁相比，發(fā)酵24h的蕓豆酵素總酚含量顯著增長約1.4倍，分析原因是原料中酚類物質(zhì)溶出，其一發(fā)酵前期發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物大量繁殖代謝產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，這些有機酸及酶類可溶出蕓豆中的酚類物質(zhì)；其二高糖濃度形成高滲透壓體系，導致原料大量酚類物質(zhì)的溶出并呈游離態(tài)。發(fā)酵32h時，總酚含量略微降低，可能是由于多酚類物質(zhì)具有抑菌效果，一定濃度的酚類物質(zhì)會抑制微生物的生長，因此發(fā)酵液中優(yōu)勢菌種會產(chǎn)生降解酚類的物質(zhì)來維持自身正常繁殖代謝。此外，蛋白質(zhì)可以與多酚類物質(zhì)的多元氫鍵和疏水鍵發(fā)生反應(yīng)，也是可能造成多酚含量下降的因素之一。隨著發(fā)酵時間的延長，部分微生物逐漸適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境中的高濃度酚，將一些大分子酚類物質(zhì)降解為單體酚或小分子量酚類物質(zhì)，發(fā)酵56h時，發(fā)酵液總酚含量進一步增長至367.90mg/mL。

由圖3可知，蕓豆酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，由初期30.02μg/mL迅速上升至56h的92.31μg/mL，增漲約3倍且具有顯著性差異（P<0.05）。發(fā)酵前期優(yōu)勢菌種酵母菌生長代謝旺盛產(chǎn)生乙醇，溶解了大部分不溶或難溶于水的黃酮類物質(zhì)，造成發(fā)酵液黃酮含量的迅速增加。整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵體系中黃酮類物質(zhì)始終以不同速率累積，一方面，發(fā)酵液的高滲環(huán)境及微生物的活動致使植物細胞破裂，原料中抗氧化物質(zhì)滲出與合成，同時酵母菌及乳酸菌代謝產(chǎn)生酶系將部分碳源轉(zhuǎn)化為可以發(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)[37]。另一方面，發(fā)酵后期糖苷與游離態(tài)黃酮類物質(zhì)結(jié)合的黃酮醇配糖體被水解，造成發(fā)酵液黃酮類物質(zhì)含量的進一步升高。

4、還原力的變化

由圖4可知，接種酵母菌和乳酸菌后，發(fā)酵液還原力均顯著高于未發(fā)酵清汁，且還原力隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)不斷上升的變化趨勢。分析原因，酵母菌和乳酸菌均可通過產(chǎn)生NADH氧化酶、SOD、GSH-Px等過氧化酶類物質(zhì)清除活性氧。酵母菌單獨發(fā)酵時，還原力最高可達0.72μmol/L，可能是由于酵母菌自身含有的細胞壁多糖能夠清除如超氧陰離子自由基等活性氧。發(fā)酵56h時，蕓豆酵素還原力為0.88μmol/L，乳酸菌自身具備的抗氧化能力主要是代謝產(chǎn)物及菌體表面的抗氧化物質(zhì)發(fā)揮作用。范昊安研究表明相較于發(fā)酵初期，蘋果梨酵素的還原力顯著升高。適當?shù)难娱L發(fā)酵時間有利于蕓豆酵素還原力的增強。

5、ABTS自由基清除率的變化

ABTS是一種穩(wěn)定存在的自由基，可與抗氧化成分發(fā)生反應(yīng)而使體系褪色，清除自由基能力由樣品對其吸光度的影響所反映。蕓豆酵素發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率的變化如圖5所示，發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先快速上升后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵前32h，ABTS自由基清除率從30.01%迅速上升至82.49%，隨后以小幅度趨勢上升至發(fā)酵后期趨于平緩，整個發(fā)酵過程蕓豆酵素ABTS自由基清除率增漲約3倍。研究表明，ABTS自由基清除能力與高濃度酚類、有機酸等物質(zhì)的芳香環(huán)數(shù)量、分子數(shù)量和羥基取代基的性質(zhì)密切相關(guān)。Anna等人發(fā)現(xiàn)酚類化合物與ABTS自由基清除率存在密切關(guān)系，分析其可能是造成蕓豆酵素具有高ABTS自由基清楚能力的主要因素。

6、相關(guān)性分析

蕓豆酵素復合發(fā)酵過程中還原糖、總酚、黃酮等功能成分與還原力、ABTS自由基清除力相關(guān)性分析結(jié)果如圖6及表1所示。還原力與ABTS自由基清除力呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P<0.01），與周偏對諾麗酵素的研究結(jié)果一致。蕓豆酵素黃酮與還原力呈極顯著正相關(guān)（r=0.99，P<0.01），與ABTS自由基清除力呈極顯著正相關(guān)（r=0.98，P<0.01）；總酚與還原力、ABTS自由基清除力均呈極顯著正相關(guān)（r=0.96，P<0.01），表明黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)是蕓豆酵素發(fā)酵過程中重要的抗氧化物質(zhì)。

探究蕓豆酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物含量以及抗氧化活性的動態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果表明，pH呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，總酸變化趨勢與之相反。發(fā)酵初期還原糖含量小幅度上升后不斷降低至3.56mg/mL。發(fā)酵56h時可溶性固形物含量達到最低6.01%?？偡雍靠傮w呈現(xiàn)上升趨勢，僅在發(fā)酵32h時略微降低。與未發(fā)酵蕓豆清汁相比，發(fā)酵48h的蕓豆酵素黃酮含量顯著提高3倍。還原力和ABTS自由基清除率呈現(xiàn)迅速升高后趨于平緩的趨勢，發(fā)酵大幅度提升蕓豆酵素的抗氧化能力，抗氧化活性的提高與總酚和黃酮含量的變化顯著正相關(guān)（P<0.05）。代謝產(chǎn)物含量的變化規(guī)律可以較為直觀反映發(fā)酵體系周期進程以及發(fā)酵液生物活性物質(zhì)積累情況。蕓豆酵素代謝產(chǎn)物和抗氧化性的研究可為酵素產(chǎn)品的開發(fā)及推廣利用提供一定的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。